APPLICATION OF MOLECULAR TECHNIQUES IN STUDYING RUMEN MICRORGANISMS IN VITRO

The general aim of this thesis was to study rumen microbial population in in vitro fermentative systems. The innovation of this work was to employ molecular methods as an additional tool to rumen in vitro systems for studying fermentation process. This tool will allow a greater understanding of the complex rumen microbial ecosystem and achieve direct measurements of microbial activity in rumen nutritional studies. The thesis includes the results of four experiments. The first experiment investigated the methodology of DNA extraction, which is one of the critical steps in any molecular analysis. In this trial, two commonly used methods of DNA extraction in rumen microbiology: the QIAamp® DNA Stool Mini Kit and the phenol chloroform with bead beating methods were compared. The results show that the kit produced a higher DNA yield, better repeatability and quality DNA than the phenol chloroform method. From the results obtained we propose a method that combines the advantages of both would be better suited for rumen studied. The next experiment observed the changes in bacterial population by employing molecular methods in an in vitro system with differences in two factors (rumen fluid source and substrate type). A good conformity was observed between the traditional fermentation measurements (volatile fatty acid, and NDF degradability) and the bacterial population results obtained through molecular analysis (i.e. QPCR). The relevance of this is that it exposes the difficult to elect one microbial group or specie to be focused on as a reference microorganism since an effect that might be appreciable in one group or specie might not be appreciable in another. Also, results demonstrate that molecular methods can be used concurrently with the conventional methods which measure end product of microbial fermentation. The third experiment involved application of molecular methods to understand fiber degradation in the rumen. The experimental study involved freshly cut perennial ryegrass incubated in sacco and analysed with molecular methods and the low scanning electron microscope to study the attached microbe in the rumen. Bacterial diversity was studied using DGGE, bacterial population using QPCR and the low scanning electron microscope to visually study the attached bacterial species. The results obtained made in evidence a considerable swift increase in the attached total bacteria, Prevotella spp., Ruminococcus albus and R. flavefaciens, up to 8hr. DGGE analysis further revealed that the attached bacteria are present only for brief periods of time. The fourth experiment involved perennial ryegrass incubated in vitro with the aim to study the effect of tannin on bacterial colonisation of Italian ryegrass hay by applying molecular methods. TRFLP analyses were used to observe the population of the attached microbes. Two restriction enzymes were evaluated in the TRFLP analyses: HaeIII and MspI. HaeIII gave higher mean peak number than the MspI restriction enzyme and is consequently suggested for use in subsequent in vitro experimental works. As revealed by QPCR results, the added tannin had an effect in vitro on the considered rumen cellulolytic microbes (R. flavefaciens and F. Succinogenes) attached to the incubated hay at 4 h post incubation. Surprisingly no significant variation was observed in the total colonising bacteria or in degradation. These results suggest a substantially resilience, complex but stable rumen microbial community in which the loss one population does not automatically mean great modifications in fiber-adherency and total overall rumen microbiome.

L’obiettivo generale di questa tesi è lo studio della popolazione microbica dei ruminanti in sistemi fermentativi in vitro. L’innovazione consiste nell’impiego di metodi molecolari come strumenti aggiuntivi nei sistemi in vitro sui ruminanti, finalizzato allo studio del processo di fermentazione. Tali strumenti permettono una maggiore comprensione di un ecosistema microbico complesso come quello dei ruminanti e conseguono misurazioni dirette della loro attività microbica. La tesi comprende i risultati di quattro esperimenti. Il primo esperimento analizza la metodologia di estrazione del DNA, in quanto processo critico di qualsiasi analisi molecolare. In questa fase sono stati comparati due metodi comunemente utilizzati per l’estrazione del DNA: il QIAamp® DNA Stool Mini Kit e il fenolo cloroformio. I risultati hanno dimostrato che il Kit produce una migliore resa, qualità e ripetibilità del DNA rispetto al secondo metodo. In base ai risultati ottenuti proponiamo un metodo che coniughi i vantaggi di entrambi. Il secondo esperimento osserva i cambiamenti nella popolazione batterica utilizzando metodi molecolari in vitro, ferme restando due differenze: la fonte del fluido del ruminante e il tipo di substrato. Tra le misurazioni tradizionali della fermentazione (acidi grassi volatili e degradabilità NDF) e i risultati ottenuti attraverso l’analisi molecolare della popolazione batterica (ad esempio QPCR) si è osservata una buona conformità. Il risultato è particolarmente rilevante perché evidenzia la difficoltà di scegliere un gruppo o una specie microbiologica come microrganismo di riferimento, visto che un effetto apprezzabile in un gruppo o specie potrebbe benissimo non esserlo in un altro. Inoltre i risultati dimostrano che i metodi molecolari possono essere utilizzati insieme a metodi convenzionali di misurazione della fermentazione microbica. Il terzo esperimento vuole applicare metodi molecolari per comprendere la degradazione delle fibre nel ruminante. A questo scopo si è utilizzato il loglio perenne appena tagliato e incubato in sacco, analizzandolo con metodi molecolari e con il microscopio elettronico a bassa scansione per studiare i microbi attaccati. La diversità batterica è stata studiata usando il DGGE; la popolazione batterica con il QPCR e il microscopio elettronico a bassa scansione per studiare dal punto di vista visivo le specie batteriche considerate. I risultati ottenuti mettono in evidenza un rapido aumento nel totale dei batteri attaccati Prevotella spp., Ruminococcus albus and R. flavefaciens, fino a otto ore. L’analisi del DGGE ha successivamente rivelato che i batteri attaccati sono presenti solo per brevi periodi di tempo. 7 Il quarto esperimento utilizza il loglio perenne incubato in vitro allo scopo di studiare l’effetto del tannino sulla colonizzazione batterica del fieno di loglio italiano attraverso l’applicazione di metodi molecolari. Per osservare la popolazione dei microbi attaccati si è ricorsi alle analisi TRFLP, valutando due enzimi di restrizione: HaeIII and MspI. Il primo ha dato un risultato maggiore rispetto al secondo ed è per questo consigliato negli esperimenti in vitro. Come rivelano i risultati del QPCR, il tannino aggiunto ha un effetto in vitro sui microbi cellulosolitici (R. flavefaciens e F. Succinogenes) attaccati al fieno incubato quattro ore dopo l’incubazione. Sorprendentemente non si è evidenziata alcuna variazione significativa in tutta la colonia batterica né nella sua degradazione. Tali risultati suggeriscono una sostanziale resilienza, una comunità microbica complessa ma stabile in cui la perdita di una popolazione non comporta automaticamente grandi variazioni nell’aderenza delle fibre e nel complessivo microbioma dei ruminanti.