Effetto inibitorio dell’eicar sulla replicazione di Betanodavirus

L’infezione da Betanodavirus è responsabile dell’EncefaloRetinopatia Virale, una malattia che causa mortalità e lesioni nervose in molte specie ittiche marine d’allevamento. I Betanodavirus, virus a ssRNA appartenenti alla famiglia Nodaviridae, sono ampiamente diffusi nel mondo anche nell’ambiente naturale. Il controllo della malattia è attualmente affidato alla selezione di riproduttori indenni ed alla profilassi diretta in avannotteria, mentre non esistono efficaci metodi di controllo da attuarsi negli allevamenti all’ingrasso dove l’elevata densità ittica e il difficile controllo delle possibili vie di ingresso del virus rendono problematica la prevenzione dei focolai estivi. Recenti studi hanno evidenziato l’efficacia e l’applicabilità delle sostanze antivirali anche nella patologia ittica individuando principi attivi inibenti la crescita virale di patogeni dei pesci. Questo lavoro ha lo scopo di valutare l’attività antivirale in vitro nei confronti di Betanodavirus dell'EICAR (5-ethynyl-1-ß-D-riobofuranosylimidazole-carboxamide), uno dei più potenti composti ad attività antivirale, analogo della ribavirina e inibitore dell’inosina monofosfato deidrogenasi. La citotossicità del composto è stata valutata nei confronti di monostrati di cellule SSN-1. Le cellule sono state incubate con diluizioni seriali di EICAR per 3 giorni, quindi il numero di cellule per pozzetto è stato contato tramite Coulter (Beckman, USA). La citotossicità è stata espressa come la concentrazione che riduce la crescita cellulare del 50% (CC50) in riferimento al numero di cellule presenti in un controllo non trattato. L’attività antivirale è stata valutata testando diluizioni seriali di EICAR su monostrati di SSN-1 infettati con un titolo virale noto. Dopo tre giorni di incubazione a 25°C è stato valutato l’effetto citopatico del virus ed è stata definita la concentrazione inibente 50% (IC50). L’indice di selettività (SI) dell’EICAR è stato calcolato come il rapporto tra il valore di CC50 e di IC50. Per meglio definire l’attività antivirale osservata per l’EICAR sono state quindi condotte prove di valutazione della carica virale su piastre da 6 pozzetti. Il virus è stato quantificato nel lisato cellulare e nel surnatante della coltura dopo 24, 48 e 72 ore di incubazione sia con real time PCR che con titolazione virale in piastre da 96 pozzetti. Le prove di citotossicità hanno dimostrato che l’EICAR non ha effetto tossico su cellule SSN-1 fino ad una concentrazione di 100 μg/ml. I saggi di attività antivirale hanno, invece, evidenziato che l’EICAR determina una riduzione della crescita virale che si attesta su valori di IC50 pari a 10,5 μg/ml. L’indice di selettività del composto risulta quindi essere superiore a 9,5. L’attività antivirale dell’EICAR è stata confermata anche tramite le prove di titolazione e quantificazione virale tramite real time PCR del surnatante e del lisato cellulare trattati con diverse concentrazioni del composto (30, 15, 5, 2 μg/ml). In particolare è stata evidenziata un’inibizione della replicazione virale statisticamente significativa rispetto al controllo virale sia a livello intracellulare che extracellulare a tutti i tempi testati, mentre non è stata evidenziata differenza nell’efficacia delle varie diluizione dell’EICAR. In conclusione si può affermare che l’EICAR ha mostrato di svolgere attività antivirale nei confronti di Betanodavirus; sarà interessante approfondire con ulteriori studi la conoscenza sul meccanismo d’azione con il quale questa sostanza inibisce la crescita virale di Betanodavirus.