Metabolomics and Transcriptomics: novel approaches to understand resistance in grape against Plasmopara viticola

The grapevine is the most economically important fruit crop worldwide. Among the species of fungi considered to be the main grapevine pathogens, downy mildew is considered to be an extremely destructive disease of the grapevine, caused by the oomycete Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni. Grapevine research is directed towards better understanding of plant defence mechanisms and characterisation of the particular plant-pathogen interactions affecting the species. One of the most promising future strategies to ensure plant protection against disease is to stop the use of chemical compounds and focus on the selection of varieties showing durable specific resistance. Understanding plant-pathogen interaction is important for the future of the breeding; indeed grapevine species can be crosses, including resistant traits using conventional breeding techniques. In the last few years, comprehensive studies called omics have been applied to model plant study and these have contributed enormously to plant science. The project aims to decipher the mechanisms responsible for resistance in vine plants, since the molecular bases of the defence mechanism against P. viticola are still poorly understood. In particular, early responses to the pathogen, occurring within the initial 96 hours post inoculation, have been investigated in grape varieties using metabolomic and transcriptomic data. The use of leaf discs is widely adopted in experiments regarding the effect of different types of biotic stress on the biochemical response of the grapevine. Since there is little knowledge regarding mechanical wounding of grapevine leaves, we analyzed changes in phenolic, lipid and carotenoid content in Bianca grapevine leaves subjected to mechanical wounding (leaf discs), testing two different sizes of leaf discs (1.1 cm and 2.8 cm in diameter). One of the most well-known defence responses in vine plants is the production of defence compounds, mainly secondary metabolites also known as phytoalexins. Primary metabolism is also involved in plant defense with the participation of different molecules including carbohydrates, organic acids, amines, amino acids and lipids not only as a source of energy but also as a source of signaling molecules to directly or indirectly trigger defense response. We developed a rapid and versatile method for the extraction, identification and quantification of different classes of grape lipids using liquid chromatographic tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We also validated a method for the identification and quantification of primary compounds belonging to different chemical classes: acids, amminoacids, amines/others and sugars using a GC-MS method of separation and identification, interesting in terms of elucidating the role of primary compounds in plant-microbe interaction in future work. In this project the primary and secondary metabolism were investigated after P. viticola infection, in Bianca grapevine leaves with the aim of covering all the most important classes of plant metabolites. Our results gave a picture of plant metabolome perturbation. Several molecules were altered in Bianca leaf discs compared to the control after P. viticola infection, and they could act as potential biomarkers in Bianca variety after infection with P. viticola. Since plant resistance and plant-pathogen interaction are complex biological processes involving many signalling pathways, the multi omic approach is most suitable for examining these traits. An integrated metabolomic and transcriptomic approach was also applied to correlate variation in gene expression and metabolic perturbation in resistant Jasmine grapevine leaves, with the aim of discovering a specific and early stage biomarkers related to Downy mildew resistance.

La vite riveste un ruolo economico molto importante a livello mondiale. La Peronospora della vite rappresenta una delle più gravi e distruttive micopatie della vite causata dall’ oomicete Plasmopara viticola (Berk. Et Curt.) Berl. et de Toni. Le attuali ricerce sono volte ad una migliore comprensione dei meccanismi di difesa delle piante e ad una caratterizzazione delle interazioni pianta-patogeno che interessano le diverse specie. Una delle strategie future più promettenti in grado di garantire la protezione delle piante contro le malattie è quella di arrestare l’utilizzo massivo di composti chimici e concentrarsi sulla selezione di varietà che mostrino una duratura resistenza specifica ai patogeni. Comprendere l'interazione pianta-patogeno è importante per il futuro del breeding; infatti le diverse specie di vite possono essere incrociate tra loro in maniera naturale per poter trasmettere i geni di resistenza. Negli ultimi anni, diversi studi omici sono stati applicati a piante modello contribuendo enormemente alla comprensione dei meccanismi del mondo vegetale. Il progetto si propone di decifrare i meccanismi responsabili della resistenza in piante di vite. In particolare, abbiamo indagato sulla risposta precoce della vite all’oomicete Plasmopara viticola in seguito ad infezione artificiale, utilizzando un approccio metabolomico e trascrittomico. L'uso di dischetti fogliari è ampiamente adottato negli studi dei diversi tipi di stress biotici sulla risposta biochimica della vite. Data la scarsa conoscenza riguardo lo stress dovuto ad un taglio meccanico, abbiamo analizzato i cambiamenti riguardanti composti fenolici, lipidi e carotenoidi in foglie di vite della varietà Bianca testando due diverse dimensioni di dischi fogliari (1,1 cm e 2,8 cm di diametro). Uno dei principali meccanismi di difesa delle piante è la produzione di composti chimici, principalmente metaboliti secondari noti anche come fitoalessine. Anche il metabolismo primario risulta essere coinvolto nella difesa delle piante mediante la partecipazione di diverse molecole, tra cui carboidrati, acidi organici, ammine, amminoacidi e lipidi non solo come fonte di energia, ma anche come molecole di segnale in grado di attivare direttamente o indirettamente la risposta di difesa. Abbiamo dunque sviluppato un metodo rapido e versatile per la quantificazione delle diverse classi di lipidi utilizzando la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS / MS). Abbiamo anche validato un metodo di quantificazione di composti primari appartenenti a diverse classi chimiche: acidi, amminoacidi, ammine / altri e zuccheri utilizzando un metodo GC-MS di separazione ed identificazione; entrambi i metodi risultano interessanti ed applicabili in futuri lavori per chiarire il ruolo del metabolismo primario nell’interazione pianta-patogeno. In questo progetto il metabolismo primario e secondario sono stati indagati in foglie di vite della varietà resistente Bianca in seguito ad infezione con Plasmopara viticola, con l'obiettivo di ricoprire tutte le più importanti classi di metaboliti vegetali. I nostri risultati hanno evidenziato l’alterazione di diverse molecole rispetto al controllo in seguito all'infezione, supponendo il loro ruolo di marcatori nella varietà di vite Bianca in seguito a infezione con Plasmopara viticola. Dal momento che la resistenza delle piante e l'interazione pianta-patogeno sono processi biologici complessi che coinvolgono molte vie di segnalazione, l'approccio multi omico è il più adatto per la loro analisi. L’integrazione di dati metbolomici e trascrittomici è stata eseguita inoltre per poter correlare la differente espressione genica e la perturbazione a livello dei metaboliti in foglie di vite della varietà resistente Jasmine, con lo scopo di identificare specifici biomarker di resistenza contro la Peronospora.