Mappaggio fine di geni di resistenza a Sharka (PPV, Plum pox virus) in albicocco (Prunus armeniaca L.) e predizione e annotazione della regione di interesse

This work is part of the national research project PRIN-VIRES. The project brings together the expertise of different Institutions (University of Udine, University of Bologna, University of Milan and University of Bari) with the aim to increase basic knowledge and develop tools and strategies for the control of Sharka for which chemical defense doesn't exist.This project foresaw several activities, oriented to the identification, isolation, and cloning of genes/QTLs of resistance to PPV in apricot. Since the functions of the gene/s under study are unknown, the positional cloning has been exploited for the identification of resistance genes. The study started from a mapped QTL in the linkage group 1 of ‘Lito’ apricot cultivar. A large population of individuals resulting from the cross ‘Lito’ (resistant) x ‘BO81604311’ (susceptible) was used to increase the map resolution. A new set of molecular markers isolated from peach genome and scaffolds of ‘Lito’ sequenced at low coverage to saturate the region where there is the resistance, and a library of BAC clones of ‘Lito’ to produce a Minimal tiling path of the region of interest for both resistant/susceptibility haplotype region. The aim was to obtain the complete sequence of the entire region under study through the Next Generation Sequencing (NGS) of BAC clones that cover this region without gaps. A set of 56 BACs were selected screening a BAC library ((30336 clones, approx. 10x genome coverage) with the molecular markers of the region under study. At the beginning, the information on the relative position of the molecular markers developed within Peach genome (http://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0) and the peach genome sequence assisted the sequence contigs ordering of each BAC clones. However, the peach genome has been initially a good-guideline, but the lack of collinearity between apricot and peach genome in several points of the region under study and the fact that in many cases BAC clone sequences turned to be fragmented in many contigs because of the presence of several repeated sequences, did not allow to solve the order and orientation of all sequences. For this reason, a preliminary new assembly of sequences of both the R and S haplotype regions in apricot were performed independently from the peach genome used initially as reference. The order of BAC contigs was solved aligning one BAC clone against each other. This process allowed the reconstruction of the largest part of the region of interest in both resistance and susceptible chromosome but a few gaps still remained to be filled. For this reason, the sequencing of the Whole ‘Lito’ genome using PacBio technology was commissioned to Amplicon Express Inc. The alignment of the contigs come from the whole genome assembly of ‘Lito’ using PacBio technology against the BAC supercontig sequences assembled previously using Illumina technology permits to identify which contigs cover the region under study for the two haplotypes. Those contings were used in order to bridge the gaps still present into and between supercontig sequences and to complete the reconstruction of the resistant/susceptible regions. Once completed, to identify the candidate gene/s related with resistance/susceptibility to Sharka disease in apricot, the genome annotation of the assembled region for the two haplotypes were performed using the Maker pipeline.

Questo lavoro è parte del progetto di ricerca nazionale PRIN-VIRES. Il progetto ha previsto la collaborazione di diverse Istituzioni (Università di Udine, Università di Bologna, Università di Milano e Università di Bari) con il fine di potenziare le conoscenze di base e sviluppare degli strumenti e strategie per il controllo della Sharka. Il progetto ha previsto diverse attività, orientate all’identificazione, isolamento e clonaggio dei geni/QTL per la resistenza a PPV in albicocco. Dal momento che le funzioni del gene/i oggetto di studio sono sconosciute, è stata adottata la strategia del clonaggio per posizione. Lo studio è partito da un QTL mappato nel gruppo di linkage 1 di ‘Lito’ (cultivar di albicocco). Sono stati utilizzati: una popolazione estesa di individui derivante dall’incrocio tra ‘Lito’ (resistente) x ‘BO81604311 (suscettibile) per aumentare la risoluzione di mappa, un nuovo set di marcatori molecolari isolati dal genoma di pesco e dagli scaffolds di ‘Lito’ sequenziati con bassa copertura per saturare la regione del QTL e una libreria di cloni BAC di ‘Lito’ per produrre il Minimal tiling path della regione di interesse per entrambi gli aplotipi (resistente/suscettibile). L’obiettivo era quello di ottenere la sequenza completa della regione oggetto di studio attraverso il sequenziamento di nuova generazione (NGS) dei cloni BAC. La posizione relativa dei marcatori all’interno del genoma di Pesco e il genoma di Pesco stesso (http://www.rosaceae.org/species/prunus_persica/genome_v1.0) hanno guidato inizialmente il riordino dei contigs dei BAC. Tuttavia, la mancanza di collinearità tra il genoma di albicocco e quello di pesco in diversi punti della regione e il fatto che i cloni BAC risultavano frammentati di molti contigs a casa della presenza di diverse sequenze ripetute non hanno permesso di risolvere l’ordine e l’orientamento di tutte le sequenze. Per questa ragione, l’assemblaggio preliminare di entrambi gli aplotipi (resistente e suscettibile) della regione di albicocco è stato ottenuto indipendentemente dal genoma di pesco usato inizialmente come riferimento. L’ordine dei contigs è stato risolvo allineando e assemblando un BAC contro l’altro. È stata ricostruita larga parte della regione di interesse in entrambi i cromosomi con alcuni gaps all’intero della sequenza. Per risolvere questo problema, è stato commissionato alla ditta ‘Amplicon Express Inc.’ il sequenziamento dell’intero genoma di ‘Lito’ utilizzando la tecnologia di sequenziamento PacBio. L’allineamento dei contig provenienti dall’assemblaggio de novo dell’intero genoma di ‘Lito’ usando dati PacBio contro l’assembly preliminare della regione ottenuto partendo da dati Illumina ha permetto di identificare i contigs provenienti dalla regione studiata per i due aplotipi. Questi contig sono stati utilizzati per chiudere i gaps ancora presenti all’interno e tra le sequenze assemblate dei BAC e completare la ricostruzione della regione per i due aplotipi. Una volta completata la ricostruzione della regione, per identificare i/il gene/i candidato/i relazionati con la resistenza/suscettibilità alla malattia Sharka, è stata fatta la predizione e l’annotazione genica della regione per i due aplotipi utilizzando la pipeline Maker.