Determinazione di biomarcatori in matrici biologiche non invasive per la valutazione dello stato di benessere del cane.

The current close relationship between humans and dogs is the result of a coevolution for a cooperative work. This close relationship has led to growing affection for the dog and a consequent increasing interest in its well-being. Then, many researches have been developed with the aim of identifying physiological bioindicators able to evaluate the animal well-being state. Furthermore, it has been found necessary to identify physiological biomarkers in non-invasive matrices, to minimize biased results caused by the sampling modality. In this thesis was taken into consideration different matrices and different biomarkers. Salivary cortisol is one of the biomarkers that was considered by studying the variation of dog salivary cortisol in the different breeds, considering also the different environments where dogs live and the different activities that they play. Saliva was collected with swabs placed gently into the cheek pouch of the dog by the owners. In this study, was derived that mean salivary cortisol was significantly higher for dogs hosted in shelters than those privately owned or in kennels (P < 0.05). Cortisol values from intact dogs did not differ between males and females, whereas for castrated males and spayed females, significantly lower values were found (P < 0.01 intact vs. castrated males; P < 0.05 intact vs. spayed females). Mean salivary cortisol concentration was significantly lower for giant and large-sized dogs than for small-sized ones (P < 0.01), whereas mean cortisol for medium-sized dogs was not significantly different from the other sizes. The interaction of site with time of sampling was significant (P < 0.05), with the highest cortisol concentration at T2 (sample collected 30 minutes after the last interaction of the day with man, when dogs were resting and relaxed) for dogs privately owned and housed in the kennels and at T0 (sample collected before the morning meal (6:00-8:00 AM), right after the first interaction of the day with the owner) for those hosted in the shelters. After these observations, the same biomarker (cortisol) and the same matrix (saliva) was considered also for working dogs. Was chosen this canine category to monitor physiological response in animals that are often subjected to various stimuli due to inter and intra-specific interactions, environmental variations and the effort required by the different activities. Moreover, it is known, that in recent years, working dogs are gaining popularity for their ability to learn and perform tasks, entertaining their human companions. The response of cortisol suggested that the extent of Hypothalamus – Pituitary – Adrenal (HPA) axis activation varies between short high-intensity activities (Agility Training) and endurance exercises (Pointing Hunting), reflecting the different metabolic engagement of these activities. Furthermore, olfactory activities seem to have low influence on cortisol secretion. Consequently, was chosen to evaluate also another aspect of dog well-being: gut microbioma through the extraction of bacterial DNA from faeces and its hypothetical correlation with diet, in particular with probiotic addition (Enterococcus Faecium). Was also collected saliva to assess the short term response of HPA axis and was collected also hair in order to evaluate cortisol for extended periods. Additionally, hair was analysed also to evaluate heavy metals, that could become another bio-indicator for dog well-being. In fact, heavy metals are closely related to environmental and nutritional pollution, and can cause serious diseases both in dogs and humans. Very little is available from the bibliography on the evaluation of heavy metal in the hair, but it seems to be a very interesting topic for the future. This preliminary investigation puts the foundation for a more in-depth study, which must necessarily take into account a larger animal sample and reduce, as far as possible, the variables of breed, age and sex.

Lo stretto rapporto instauratosi tra uomo e cane è il frutto di una coevoluzione sviluppatasi inizialmente con scopi di collaborazione ‘lavorativa’, ma che in seguito, per l’uomo, ha portato ad un crescente sviluppo di affettività nei confronti del cane e ad uno sviluppato interesse per il benessere dell’animale stesso. Portando inoltre ad un aumento delle ricerche che hanno come obiettivo l’identificazione di biomarcatori fisiologici del benessere animale, in matrici non invasive. Nella prima parte di questa ricerca, si è valutato le variazioni del cortisolo salivare in diverse razze di cani, nei diversi ambienti in cui vivevano e nelle diverse attività che svolgevano. I risultati ottenuti in questo primo studio hanno mostrato come la concentrazione media del cortisolo salivare fosse significativamente più alta nei cani ospitati in rifugi rispetto a quelli che vivevano con i loro proprietari o nei canili (P <0.05). Inoltre, non si sono rilevate differenze significative di concentrazioni di cortisolo tra cani interi, mentre, per i maschi e le femmine sterilizzati, sono stati trovati valori di cortisolo significativamente inferiori rispetto ai cani interi (P <0.01 maschi interi vs. maschi sterilizzati; P <0.05 femmine intere vs. femmine sterilizzate). Si è rilevata inoltre, una concentrazione media di cortisolo significativamente inferiore per i cani di taglia gigante e quelli di taglia grande rispetto ai cani di piccola taglia (P <0.01), mentre, la concentrazione media di cortisolo per i cani di media taglia non ha fatto registrare livelli significativamente diversi dalle altre taglie. L'interazione tra l’ambiente in cui vivevano i cani e il tempo di campionamento è risultata essere significativa (P <0.05): al tempo T2 (campione raccolto 30 minuti dopo l'ultima interazione del giorno tra cane e uomo, quando i cani erano in uno stato di riposo e rilassamento) si sono rilevate concentrazioni di cortisolo più alte nei cani di privati e nei cani dei canili, per i cani in allevamento invece, questo si è verificato al tempo T0 (campione raccolto prima del pasto del mattino (6: 00-8: 00 AM) subito dopo la prima interazione della giornata con il proprietario). In seguito, lo stesso biomarcatore (cortisolo) e la stessa matrice (saliva) sono stati considerati anche per i cani in attività fisica. I risultati ottenuto da questa ricerca hanno mostrato variazioni di concentrazioni di cortisolo tra le attività che richiedono un’alta intensità di sforzo fisico (Agility Training) e quelle che richiedono resistenza (Pointing Hunting). Inoltre, le attività olfattive sembrano avere una scarsa influenza sulla secrezione di cortisolo. In seguito a questa valutazione sul cortisolo salivare, è stato preso in considerazione un altro aspetto del benessere del cane: il microbioma intestinale. Dai campioni fecali raccolti, è stata fatta l'estrazione del DNA batterico ed stata valutata una sua possibile correlazione con la dieta, in particolare con l’utilizzo del probiotico (Enterococcus Faecium) come additivo alla dieta. Per questo studio è stata inoltre raccolta la saliva per valutare la risposta a breve termine dell'asse HPA e il pelo per poter valutare le variazioni di cortisolo in relazione al lungo periodo. Inoltre, il pelo raccolto è stato analizzato per valutare le concentrazioni di metalli pesanti presenti al suo interno. I metalli pesanti potrebbero essere infatti presi in considerazione come indicatori biologici per il benessere del cane. I metalli pesanti sono indicatori strettamente legati all'inquinamento ambientale e nutrizionale e inoltre, alcuni di loro, possono anche causare gravi malattie sia nei cani che negli esseri umani. La bibliografia e quindi i dati a disposizione in merito a questo ultimo argomento sono pochi, ma ci sono buoni presupposti affinché possa diventare un’indagine da sviluppare e approfondire in futuro anche come strumento di valutazione del benessere animale.