PHARMACOGENETICS OF FLUOROPYRIMIDINES: FROM THE IMPLEMENTATION OF GUIDELINES TO IDENTIFICATION OF NOVEL GERMLINE VARIANTS RELATED TO TOXICITY

Precision medicine finds a valuable ally in pharmacogenomics which is aimed at identifying genetic variants involved in therapeutic response. In tailored treatments, a specific attention is required for those drugs showing a low therapeutic index, such as fluoropyrimidines (FL) which represent the backbone in the management of many types of solid tumours. FL lead to severe toxicity (G≥3) in a considerable percentage of patients, occasionally resulting in patients death. FL are mainly metabolized by dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD; DPYD) into inactive metabolite. At present only four DPYD genetic variants (DPYD *2A, DPYD *13, DPYD c.2846A>T and DPYD-HapB3) are known to decrease DPD activity and consequently to be associated to FL-related toxicity. The four SNP genotyping test is recommended before an FL-based treatment by international shared pharmacogenetic guidelines, Despite the high specificity, this test demonstrated a low sensitivity, leaving the majority of the toxic events unexplained. Recently, the previously neglected role of novel and rare genetic variants in the intra-individual variability in the response to drugs has emerged. In this PhD thesis, we aimed at improving the knowledge on the clinical validity and clinical utility of the DPYD clinical diagnostic test proposed by the current pharmacogenomic guidelines, by investigating the impact of the four DPYD variants on fluoropyrimidines-related toxicity and costs for toxicity management in large cohorts of patients. In addition, we analysed the contribution of novel and rare genetic variants in a set of pharmaco-genes in the development of fluoropyrimidines-related toxicity. Here, we show how the four-SNPs test for DPYD allow to identify a large number of patients who will develop severe adverse reactions to FL-based treatment in a group of 763 oncological patients. This is especially true if the four DPYD SNPs are arranged in the so-called gene activity score (GAS) weighing each SNP according to its specific impact on the DPD protein phenotype. We also demonstrated, in a subset of 550 colorectal cancer patients, how the DPYD genotype for the four-SNPs set or the GAS are related to the management cost for severe toxicities related to FL. This finding has notable implication in the utility of the test warranting its application in the routine clinical practice. We subsequently analyzed, by a next generation sequencing approach, the potential role of novel or rare variants in genes in the detoxification pathway in 108 patients that are wild type for the well-know 4 DPYD risk variants and developed severe FL-related toxicity. We identified 9 rare DPYD variants, 3 were very rare missense (c.G345C, p.M115I; c.A2060C p.D687A and c.A2137G, p.N713D), and 6 were singleton missense (c.A110G, p.D37G; c.G481A, p.E161K; c.C800T, p.T267I; c.G958A, p.G320R; c.A1110G, p.I370M;c.C1579T, p.P527S). in comparison, a population of 106 patients treated with a FL-based regimen, without any adverse reaction, displayed a depletion of novel variants (p value =0.001, by Fisher’s Exact Test). Also, as expected, we found a statistically significant enrichment of rare, very rare and novel exonic DPYD variants in the cohort of patients with severe toxicity as compared to those without (P =0.0187, P =0.0187, P =0.0291, respectively, , by Fisher’s Exact Test). Despite the clinical need of tailoring treatment on each patient, to date translating the genetic information of each patient into a therapeutic indication remains a challenging task. The study of the pharmacogenomics in FL-based treatment has already provided useful and valid markers for the clinical practice, the study of rare and novel genetic variants could in the future further improve available tools for a precision medicine in cancer treatment.

La medicina di precisione trova un valido alleato nella farmacogenomica che mira a identificare varianti genetiche coinvolte nella risposta terapeutica. Nei trattamenti su misura, è necessaria un'attenzione particolare per quei farmaci che mostrano un basso indice terapeutico, come le fluoropirimidine (FL) che rappresentano la spina dorsale nella gestione di molti tipi di tumori solidi. FL portano a una grave grave tossicità (G≥3) in una percentuale considerevole di pazienti, causando occasionalmente la morte dei pazienti. Le FL sono metabolizzate principalmente dalla diidropirimidina deidrogenasi (DPD; DPYD) in metaboliti inattivi. Attualmente sono note solo quattro varianti genetiche della DPYD (DPYD * 2A, DPYD * 13, DPYD c.2846A> T e DPYD-HapB3) che riducono l'attività della DPD e di conseguenza sono associate alla tossicità correlata alla FL. I quattro SNP utilizzati nel test di genotipizzazione sono raccomandati prima dell’inizio di un trattamento basato su FL. Nonostante l'elevata specificità, questo test ha dimostrato una bassa sensibilità, lasciando inspiegabile la maggior parte degli eventi tossici. Recentemente, è emerso il ruolo precedentemente trascurato di nuove e rare varianti genetiche nella variabilità intra-individuale nella risposta ai farmaci. In questa tesi di dottorato, abbiamo mirato a migliorare le conoscenze sulla validità clinica e l'utilità clinica del test diagnostico clinico DPYD proposto dalle attuali linee guida farmacogenomiche, studiando l'impatto delle quattro varianti della DPYD sulla tossicità correlata alle fluoropirimidine e ai costi per la gestione della tossicità in grandi coorti di pazienti. Inoltre, abbiamo analizzato il contributo di varianti genetiche nuove e rare in una serie di farmaco-geni nello sviluppo della tossicità correlata alle fluoropirimidine. Qui, mostriamo come il test dei quattro SNP per DPYD consente di identificare un gran numero di pazienti che svilupperanno gravi reazioni avverse al trattamento a base di FL in un gruppo di 763 pazienti oncologici. Ciò è particolarmente vero se i quattro SNP DPYD sono disposti nel noto punteggio di attività genica (GAS) che pesa ciascun SNP in base al suo impatto specifico sul fenotipo della proteina DPD. Abbiamo anche dimostrato, in un sottogruppo di 550 pazienti con carcinoma del colon-retto, come il genotipo DPYD per il set di quattro SNP o il GAS siano correlati al costo di gestione per gravi tossicità correlate alla FL. Questa scoperta ha notevoli implicazioni nell'utilità del test che ne garantisce l'applicazione nella pratica clinica di routine. Successivamente abbiamo analizzato, con un approccio di sequenziamento di nuova generazione, il ruolo potenziale di varianti nuove o rare nei geni nella via di disintossicazione in 108 pazienti che non presentano le ben note 4 varianti di rischio DPYD e sviluppato grave tossicità correlata al FL. Abbiamo identificato 9 rare varianti di DPYD, 3 erano missense molto rare e 6 erano missense uniche. In confronto, una popolazione di 106 pazienti trattati con un regime basato su FL, senza alcuna reazione avversa, ha mostrato una riduzione di nuove varianti (valore p = 0,001, secondo il test esatto di Fisher). Inoltre, come previsto, abbiamo trovato un arricchimento statisticamente significativo di varianti esoniche rare, molto rare e nuove sulla DPYD nella coorte di pazienti con grave tossicità rispetto a quelle senza. Nonostante la necessità clinica di personalizzare il trattamento su ciascun paziente, ad oggi tradurre le informazioni genetiche di ciascun paziente in un'indicazione terapeutica rimane un compito impegnativo. Lo studio della farmacogenomica nel trattamento a base di FL ha già fornito marcatori utili e validi per la pratica clinica, lo studio di varianti genetiche rare e nuove potrebbe in futuro migliorare ulteriormente gli strumenti disponibili per una medicina di precisione nel trattamento del cancro.