Il ruolo della plasticità e della memoria del mastocita in salute e malattia: un modello 3D per studiare l'interazione tra organoidi intestinali e mastociti

Mast Cells (MCs) are long-living innate immune cells widely distributed in mucosal and connective tissues. They are located at the interface with the external environment, therefore are among the first cell types that can get in contact with pathogens. The main aim of this PhD thesis is to shed light on what underlies the heterogeneity of the MCs, to finally test the plasticity of their response to different stimulatory environments. Since microbial ligands are known to induce innate immune memory on Macrophages (Mϕ) and Natural Killer (NK) cells, to study whether it could be true also for MCs, they were stimulated for 24 hours with different inflammatory or infective stimuli, allowed to rest for 6 days and then restimulated with the same or others pathological stimuli in order to assess if an enhanced (training) or a reduced (tolerance) response was induced. In LPS primed MCs, a slight increase of TNFα and IL-6 release was induced when restimulated with living C. Albicans, while it was strongly reduced in LPS restimulated MCs, and this was evident also at transcriptional level. Moreover, the LPS prestimulation made MCs more prone to express MCPT-4, thus suggesting a possible role of this protease in the training or tolerance effect exerted on MCs by LPS prestimulation. Sodium Butyrate (NaB, microbial derivative) effects on MCs priming were also analysed, and it was demonstrated that it inhibited MCs degranulation (at short and long time) and TNFα release after different inflammatory stimulations. The gut is characterized by a great cellular variability, which make it a very complex stimulating environment. Therefore, MCs plasticity of response was also evaluated in the context of healthy and pathological intestinal organoid cultures. Healthy murine small intestine and colon organoids were produced as well as of inflamed (DSS derived) and tumoral (AOM/DSS derived) tissue ones, that were used for the co-culture with bone marrow derived MCs (BMMCs). Resting and IgE/Ag activated BMMCs induced different effects on healthy and pathological organoids, in terms of composition (analysed as mRNA expression of intestinal epithelial marker as Lgr5, Lyz1, Muc2, ChgA and SI) and structural architecture (analysed as mRNA expression and/or as protein expression of Cld4, Cdh1, ZO-1 and Ezrin). Moreover, BMMCs were able to perceive healthy from pathological tissue differently, responding in a specific way. Thus, protease expression profile and activation status of BMMCs indicated that tumoral organoids are capable of inducing substantial MCs activation response, in the absence of other external stimuli. In this scenario, IL-33 organoid expression and TNFα release by BMMCs seem to play a central role, creating a cytokine environment in which IL-33 stimulates BMMCs to produce TNFα that in turn induces a different structural effects depending on the microenvironment. Experiments carried out with NaB (that inhibits BMMCs activation) and TNFα-/- BMMCs further supported these data. These results indicate that MCs are important mediators of tissue homeostasis, and that a different stimulatory environment can shape and direct MCs specific response towards the dampening or propagation of the inflammatory response.

I mastociti (MC) sono cellule dell’immunità innata caratterizzate da una lunga emivita. Sono localizzate all’interfaccia con l’ambiente esterno, il che fa sì che i MC siano tra le prime cellule ad interagire con gli agenti patogeni nocivi per l’organismo. Il principale scopo di questa tesi è di mettere in luce ciò che caratterizza l’eterogeneità dei MC ed in fine analizzare la plasticità della loro risposta a diversi ambienti stimolatori. Dal momento che è risaputo che diversi antigeni microbici sono in grado di indurre memoria immunitaria innata in macrofagi e cellule Natural killer, al fine di studiare se ciò fosse vero anche per i MC, questi sono stati stimolati per 24 ore con diversi agenti infettivi o pro-infiammatori, e dopo 6 giorni di recupero, sono stati ristimolati con gli stessi e altri agenti per studiare se ciò inducesse una maggiore (training) o minore (tolleranza) risposta dei MC. MC prestimolati con LPS mostrano un aumento nel rilascio di TNFα ed IL-6 quando ristimolati con C. Albicans viva, mentre mostrano una riduzione del rilascio di tale citochina quando ristimolate con una seconda dose di LPS. Inoltre, la prestimolazione con LPS rende i MC più proni ad esprimere la proteasi mastocitaria MCPT-4, suggerendo che questa possa avere un ruolo nell’effetto di training o tolleranza indotto dal prestimolo LPS sui MC. Anche l’effetto della prestimolazione dei MC con Sodio Butirrato (conosciuto derivato microbico) è stato analizzato, ed è stato dimostrato che è in grado di inibire sia la degranulazione del MC a tempi brevi e a tempi lunghi (dopo una settimana dal prestimolo), sia il rilascio di TNFα in seguito a diverse stimolazioni pro-infiammatorie. L’intestino è caratterizzato da grande variabilità cellulare, il che lo rende un ambiente stimolatorio complesso. Per questo motivo la plasticità della risposta mastocitaria è stata valutata anche nel contesto di colture di organoidi intestinali sani e patologici. A tale scopo sono state prodotte colture di organoidi a partire da sezioni di colon e intestino tenue murini sani, e da tessuto intestinale infiammato (DSS) e tumorale (AOM/DSS) che sono stati utilizzati per co-colture con MC derivati da midollo osseo murino (BMMCs). MC non attivati ed attivati mediante stimolo IgE/Ag inducono effetti diversi a seconda che siano stati coltivati con organoidi sani o patologici: a tale scopo sono stati valutati la composizione cellulare (analizzata tramite l’espressione in mRNA di marcatori di cellule epiteliali intestinali quali Lgr5, Lyz1, Muc2, ChgA e SI) e l’architettura degli organoidi (analizzata mediante lo studio dell’espressione genica e/o dell’espressione e localizzazione proteica di Cld4, Cdh1, ZO-1 e Ezrin). I MC sono in grado di percepire in maniera differente il tessuto sano da quello patologico, e di conseguenza rispondono in maniera diversa a seconda del contesto. Infatti, il profilo di espressione delle proteasi e lo stato di attivazione e proliferazione dei MC indica che gli organoidi derivati da tessuto tumorale sono in grado di indurre una sostanziale attivazione dei MC in assenza di ulteriori stimoli attivatori. In questo contesto, l’espressione di IL-33 da parte degli organoidi e il rilascio di TNFα da parte dei MC pare giocare un ruolo di rilevo, creando un ambiente citochinico in cui l’IL-33 stimola il MC a rilasciare TNFα che induce effetti diversi a seconda del microambiente. Esperimenti effettuati con MC prestimolati con Sodio butirrato o con MC TNFα -/- sono stati effettuati a supporto di questa ipotesi. Questi risultati indicano che i MC sono importanti mediatori dell’omeostasi tissutale e che ambienti stimolatori diversi possono modellare e dirigere una risposta mastocitaria specifica verso una riduzione o una propagazione della risposta infiammatoria.