Caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture liquide di caffè

Gli esosomi sono vescicole extracellulari (EVs) sferiche e di dimensioni generalmente comprese tra 50 e 150 nm, coinvolte nel trasporto di biomolecole e nella comunicazione intercellulare. Soprattutto per quanto riguarda quelli di origine vegetale, sono ancora poco conosciuti e studiati, ma stanno guadagnando crescente attenzione in quanto in futuro potrebbero avere promettenti applicazioni biomediche e agronomiche. In questo lavoro di tesi sono stati isolati e caratterizzati esosomi prodotti da cellule di caffè. Come materiale di partenza è stato scelto di utilizzare le sospensioni cellulari, in modo tale da poter isolare gli esosomi attraverso centrifugazioni differenziali, in quanto rilasciati dalle cellule nel mezzo colturale. Sono state ottenute due frazioni di esosomi: la prima ricavata da una centrifugazione di 36 minuti a 100'000 g e la seconda isolata in seguito ad un’ulteriore centrifugazione di 6 ore a 125'000 g. È stata effettuata una caratterizzazione della morfologia e delle dimensioni di queste vescicole attraverso il saggio di diffusione dinamica della luce (DLS) e tramite immagini ricavate al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) e analizzate con il software ImageJ. Dai risultati ottenuti è possibile affermare che le EVs di caffè isolate in questo esperimento hanno diametro compreso tra i 30 e i 200 nm, paragonabile alle dimensioni di altri esosomi di origine vegetale indicati in letteratura. Per una valutazione indiretta della quantità di esosomi presenti nei campioni, è stata misurata la concentrazione di proteine attraverso il saggio di Bradford. I dati indicano un maggiore contenuto proteico nella frazione ottenuta dalla centrifugazione di 6 ore. Ciò potrebbe essere dovuto alla diversa composizione delle vescicole rispetto a quelle contenute nell’altra frazione. Infine, attraverso il Western blot è stato possibile identificare l’origine delle vescicole, individuando componenti proteiche del plasmalemma e del reticolo endoplasmatico. Non si sono evidenziati, invece, marcatori di membrane di vacuolo e del Golgi.