L’amyloodiniosi, ovvero l’infezione sostenuta dal protozoo ectoparassita Amyloodinium ocellatum, è un serio problema per l’acquacoltura semi-intensiva nel bacino Mediterraneo, specialmente nei mesi più caldi quando si possono registrare tassi di mortalità anche del 100%. Nonostante questa infezione sia responsabile di ingenti perdite produttive, al momento non esistono presidi terapeutici che al contempo siano efficaci e autorizzati dalla legislazione nazionale e europea. Il solfato di rame (composto di prima scelta) e la formaldeide sono utilizzati per il controllo dell’infezione, in quanto efficaci sulle dinospore (stadio infettante), tuttavia essi non sono attualmente registrati in Italia per l’uso farmacologico. Allo scopo di ridurre l’impatto che queste sostanze possono avere sull’ambiente e sulla salute animale, nell’ambito del progetto Horizon2020 ParaFishControl sono previste indagini mirate alla ricerca di terapie eco-sostenibili e attente al benessere animale. In quest’ottica, il nostro gruppo di ricerca sta valutando l’effetto in vitro di un pannello di 16 composti di origine vegetale sulla motilità di dinospore di A. ocellatum. Le dinospore, originatesi in laboratorio da tomonti prelevati da un episodio spontaneo di malattia, sono state contate con camera conta cellule (S50 Sedgewick Rafter Cell, Pyser – SGI), quindi portate alla concentrazione approssimativa di 5200 dinospore/ml in terreno di coltura HBSS/IO2 (1:1). Successivamente, esse sono state seminate in micropiastra da 96 pozzetti (100 µl/pozzetto) in cui precedentemente erano state allestite diluizioni seriali delle 16 sostanze oggetto di studio: 2I,4I – diidrossicalcone; 7 – idrossiflavone; acido rosmarinico; artemisinina; canfora (1R); diallil solfuro; esculetina; eucaliptolo; garlicina 80%; harmalolo idrocloruro diidrato; palmatina cloruro; piperina; resveratrolo; sclareolide; tomatina e umbelliferone. Ciascuna concentrazione di composto (6,25 µg/ml – 50 µg/ml, 100 µl/pozzetto) è stata saggiata in duplicato. Come controllo inibente positivo è stato utilizzato il solfato di rame (0,25 – 1 µg/ml), mentre il controllo negativo consisteva in dinospore incubate in solo terreno di coltura. Mediante camera per sedimenti urinari (Vacutest Kima precision cell) sono state osservate al microscopio ottico aliquote (50µl/pozzetto) prelevate dalla piastra dopo 1, 6 e 24 ore di incubazione a temperatura ambiente, al fine di contare le dinospore non motili. Quindi è stata calcolata la percentuale di dinospore ancora natanti per ciascuna concentrazione di composto e ai diversi tempi di incubazione. Fra le sostanze saggiate, la tomatina e il 2I,4I – diidrossicalcone hanno ridotto notevolmente e con effetto dose-dipendente il moto delle dinospore. Per questo motivo i due composti sono stati ulteriormente saggiati in un range più ampio di concentrazioni (0,39 – 50 µg/ml). La tomatina è risultata in grado di arrestare la motilità del 100% sin dalla prima ora di incubazione fino alla concentrazione di 6,25 µg/ml. Invece, alle concentrazioni minori (0,39 – 3,13 µg/ml) più dell’80% dei protozoi era attivo anche dopo 24 ore di incubazione. Il flavonoide 2I,4I – diidrossicalcone si è rivelato inibitore solo alle concentrazioni più elevate (50 e 25 µg/ml) nella prima ora d’incubazione, mentre la sua efficacia è risultata limitata a concentrazioni ≤ 12,5 µg/ml e in generale dopo 6 ore di incubazione. Le altre sostanze non hanno avuto alcun effetto rilevante sulla motilità dei protozoi, mentre il solfato di rame si è dimostrato efficace alla concentrazione di 1 µg/ml nelle prime ore di incubazione. Ulteriori studi in vitro sono necessari per approfondire le conoscenze sull’attività di queste molecole e per selezionare in vivo dosi di tomatina e 2I,4I – diidrossicalcone non tossiche per i pesci.

Effetti in vitro di 16 composti di origine vegetale sulla motilità di dinospore di Amyloodinium ocellatum.

Massimo, M.;Beraldo, P.;Bulfon, C.;Volpatti, D.;Galeotti, M.
2017

Abstract

L’amyloodiniosi, ovvero l’infezione sostenuta dal protozoo ectoparassita Amyloodinium ocellatum, è un serio problema per l’acquacoltura semi-intensiva nel bacino Mediterraneo, specialmente nei mesi più caldi quando si possono registrare tassi di mortalità anche del 100%. Nonostante questa infezione sia responsabile di ingenti perdite produttive, al momento non esistono presidi terapeutici che al contempo siano efficaci e autorizzati dalla legislazione nazionale e europea. Il solfato di rame (composto di prima scelta) e la formaldeide sono utilizzati per il controllo dell’infezione, in quanto efficaci sulle dinospore (stadio infettante), tuttavia essi non sono attualmente registrati in Italia per l’uso farmacologico. Allo scopo di ridurre l’impatto che queste sostanze possono avere sull’ambiente e sulla salute animale, nell’ambito del progetto Horizon2020 ParaFishControl sono previste indagini mirate alla ricerca di terapie eco-sostenibili e attente al benessere animale. In quest’ottica, il nostro gruppo di ricerca sta valutando l’effetto in vitro di un pannello di 16 composti di origine vegetale sulla motilità di dinospore di A. ocellatum. Le dinospore, originatesi in laboratorio da tomonti prelevati da un episodio spontaneo di malattia, sono state contate con camera conta cellule (S50 Sedgewick Rafter Cell, Pyser – SGI), quindi portate alla concentrazione approssimativa di 5200 dinospore/ml in terreno di coltura HBSS/IO2 (1:1). Successivamente, esse sono state seminate in micropiastra da 96 pozzetti (100 µl/pozzetto) in cui precedentemente erano state allestite diluizioni seriali delle 16 sostanze oggetto di studio: 2I,4I – diidrossicalcone; 7 – idrossiflavone; acido rosmarinico; artemisinina; canfora (1R); diallil solfuro; esculetina; eucaliptolo; garlicina 80%; harmalolo idrocloruro diidrato; palmatina cloruro; piperina; resveratrolo; sclareolide; tomatina e umbelliferone. Ciascuna concentrazione di composto (6,25 µg/ml – 50 µg/ml, 100 µl/pozzetto) è stata saggiata in duplicato. Come controllo inibente positivo è stato utilizzato il solfato di rame (0,25 – 1 µg/ml), mentre il controllo negativo consisteva in dinospore incubate in solo terreno di coltura. Mediante camera per sedimenti urinari (Vacutest Kima precision cell) sono state osservate al microscopio ottico aliquote (50µl/pozzetto) prelevate dalla piastra dopo 1, 6 e 24 ore di incubazione a temperatura ambiente, al fine di contare le dinospore non motili. Quindi è stata calcolata la percentuale di dinospore ancora natanti per ciascuna concentrazione di composto e ai diversi tempi di incubazione. Fra le sostanze saggiate, la tomatina e il 2I,4I – diidrossicalcone hanno ridotto notevolmente e con effetto dose-dipendente il moto delle dinospore. Per questo motivo i due composti sono stati ulteriormente saggiati in un range più ampio di concentrazioni (0,39 – 50 µg/ml). La tomatina è risultata in grado di arrestare la motilità del 100% sin dalla prima ora di incubazione fino alla concentrazione di 6,25 µg/ml. Invece, alle concentrazioni minori (0,39 – 3,13 µg/ml) più dell’80% dei protozoi era attivo anche dopo 24 ore di incubazione. Il flavonoide 2I,4I – diidrossicalcone si è rivelato inibitore solo alle concentrazioni più elevate (50 e 25 µg/ml) nella prima ora d’incubazione, mentre la sua efficacia è risultata limitata a concentrazioni ≤ 12,5 µg/ml e in generale dopo 6 ore di incubazione. Le altre sostanze non hanno avuto alcun effetto rilevante sulla motilità dei protozoi, mentre il solfato di rame si è dimostrato efficace alla concentrazione di 1 µg/ml nelle prime ore di incubazione. Ulteriori studi in vitro sono necessari per approfondire le conoscenze sull’attività di queste molecole e per selezionare in vivo dosi di tomatina e 2I,4I – diidrossicalcone non tossiche per i pesci.
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