Application of Supercritical Fluids Technology on winery by-products

Winemaking process produces a large amount of solid wastes, including grape marc and wine lees. In 2014, the Italian production of grapes was estimated to be 6 million tons, which corresponds to about 1.5 million tons of grape marc. The new European regulations about the organization of winery sector and waste management (EC 479/2008 and EC 555/2008) have revoked the compulsory distillation of the by–products of winemaking, creating a great problem on winery waste handling and disposal. Grape marc has a heavy environmental impact for the high content of phenols that considerably increase chemical and biochemical oxygen demands. This biomass could be disposed and valorised first by extraction of added-value bioactive compounds and then by production of biopolymers and bio-fuels. One of the higher value options is the recovery of polyphenols, which could be used in pharmaceutical, cosmetic and food industry. In this regard, this PhD thesis aimed to study the application of Supercritical Fluid Extraction (SFE) and Supercritical Anti-Solvent (SAS) process to recover bioactive compounds of high-added value from grape marc, in particular polyphenols, which show beneficial effects on human health against several diseases. SFE with supercritical carbon dioxide (SC-CO2) has been widely used for the extraction from natural products. It is an environment-friendly technology, which represents an alternative to conventional extraction techniques and offers several advantages over classical solvent extraction methods. For the extraction of polar compounds, such as polyphenols, a co-solvent/modifier is necessary to add to SC-CO2. Three different “green” SC-CO2 co-solvents were investigated: ethanol, water and an ethanol aqueous mixture with 57%(v/v) ethanol concentration. The effect of pressure, temperature, CO2 flow rate and percentage of co-solvent, which are the main process parameter of a SFE process, were studied for each co-solvent used. The results indicated that SFE process carried out using the ethanol aqueous mixture (57% v/v) as co-solvent at 8 MPa, 40°C, 6.0 kg/h of CO2 flow rate added with 10% of co-solvent, showed the best results for Total Polyphenol Content (TPC), Antioxidant activity and Proanthocyanidins. A combination of ultrasound assisted extraction (UAE) and supercritical carbon dioxide (SC-CO2) extraction to maximize polyphenols recovery from grape marc was studied. It is well known that ultrasounds waves can improve the extraction processes with their cavitational effect. The effect of temperature and time of UAE on polyphenols compounds was investigated by 22 full factorial design. The highest concentration of polyphenols was obtained at 80°C and 4 minutes of ultrasound extraction. The obtained UAE-Raffinates were extracted by supercritical carbon dioxide. The overall extraction curves (OECs) of the UAE-Raffinates extracted by SC-CO2 were described and evaluated. The performance of the combined process has been checked by comparison of total polyphenol content, proanthocyanidin fractions and antioxidant activity with both UAE and SC-CO2 extraction. Supercritical Fluids can be used not only for extraction methods, but also for other purposes. The peculiar properties of supercritical fluids can be exploited in micronization processes. The precipitation of pharmaceutical and natural products has attracted great attention in recent years. The conventional techniques, including spry-drying, freeze-drying, liquid antisolvent crystallization or milling processes, show several disadvantages: (1) production of coarse particles, (2) mechanical or thermal degradation of the products, and (3) final products with low purity. For these reasons, a micronization process with supercritical carbon dioxide (SC-CO2), namely supercritical anti-solvent (SAS) process, was applied to recover polyphenol compounds from grape marc extract. A 23 factorial design was applied to study the effect of the main SAS process parameters (pressure, temperature and CO2 molar fraction) on recovered particles, total polyphenol compound (TPC) and antioxidant activity. The precipitates with high quality was obtained at 12 MPa, 45°C and 0.99 of CO2 mole fraction. Fractionation of proanthocyanidins, as well as HPLC-DAD analysis of polyphenols and scanning electronic microscopy (SEM) analysis were performed on the best products obtained by SAS. Economic considerations, based on the literature data, and future perspectives regarding the application of supercritical fluids processes were discussed

Il processo di vinificazione genera una grande quantità di residui solidi, costituiti principalmente da vinacce e fecce. Nel 2014 la produzione italiana di uva ammontava a 6 milioni di tonnellate, che corrispondono a una produzione di circa 1.5 milioni di tonnellate di vinaccia. La nuova regolamentazione della Comunità Europea riguardante il settore vitivinicolo e la gestione dei rifiuti (CE 479/2008 e CE 555/2008) ha introdotto una progressiva diminuzione, fino alla totale scomparsa, della distillazione obbligatoria dei sottoprodotti dell’industria enologica. Tutto ciò ha comportato enormi problemi e disagi nella gestione e nell’utilizzo di questi sottoprodotti. La vinaccia ha un enorme impatto dal punto di vista ambientale e a causa del suo alto contenuto in sostanze polifenoliche determina un aumento dei valori di COD e BOD dell’ambiente. Questo sottoprodotto può essere sfruttato e valorizzato mediante l’estrazione di composti bioattivi ad alto valore aggiunto e successivamente per la produzione di biopolimeri, energia e/o biocarburanti. Una delle opzioni di maggior interesse è il recupero di polifenoli, che possono essere utilizzati in campo farmaceutico, cosmetico e alimentare. In questo contesto, questa tesi di dottorato ha come obiettivo lo studio dell’estrazione con fluidi supercritici (SFE) e il recupero mediante la tecnologia SAS (Supercritical Anti-Solvent) di composti bioattivi ad alto valore aggiunto da vinacce d’uva, in particolare le sostanze polifenoliche che possiedono effetti benefici sulla salute umana. L’estrazione SFE, con il diossido di carbonio allo stato supercritico (SC-CO2), è ampiamente utilizzata per l’estrazione di matrici naturali. È una tecnologia eco-compatibile ed eco-sostenibile, che rappresenta un’alternativa alle tecniche di estrazione convenzionali e offre diversi vantaggi rispetto all’estrazione classica con solventi. Per l’estrazione di composti polari, come sono i polifenoli, è necessaria l’aggiunta di un co-solvente al diossido di carbonio allo stato supercritico. Tre diversi tipi di co-solvente sono stati studiati: etanolo, acqua e una miscela etanolo/acqua, con una concentrazione in etanolo del 57% (v/v). Per ciascun co-solvente utilizzato, sono stati valutati gli effetti dei principali parametri operativi dell’estrazione con fluidi supercritici: pressione, temperatura, flusso di CO2 e percentuale di co-solvente utilizzato. I risultati ottenuti indicano che l’estrazione con CO2 supercritico addizionato con la miscela etanolo/acqua (57% v/v) come co-solvente a 8 MPa, 40°C, 6.0 kg/h di flusso di CO2 e 10% di co-solvente, ha permesso di ottenere i risultati migliori per quanto riguarda il contenuto di polifenoli totali, l’attività antiossidante e il contenuto di proantocianidine. L’accoppiamento dell’estrazione assistita con ultrasuoni (UAE) e dell’estrazione con CO2 supercritico è stato studiato, con l’obiettivo di massimizzare il recupero di polifenoli da vinacce d’uva. È noto che gli ultrasuoni permettono di migliorare i processi estrattivi grazie al fenomeno della cavitazione. Un disegno sperimentale fattoriale completo (22) è stato applicato per lo studio dell’effetto della temperatura e del tempo del processo UAE. La più alta concentrazione di polifenoli è stata ottenuta nell’estrazione con ultrasuoni condotta a 80°C per 4 minuti. Successivamente, i residui solidi ottenuti dalle prove di estrazione con ultrasuoni sono stati estratti ulteriormente con l’SFE. Le cinetiche di estrazione (OECs) delle prove con CO2 supercritico sono state considerate e studiate. La combinazione dei due processi estrattivi è stata valutata considerando il contenuto totale di polifenoli, l’attività antiossidante e il contenuto di proantocianidine degli estratti ottenuti con UAE e SFE. I fluidi supercritici posso essere utilizzati non solamente nei processi estrattivi, ma anche per altri scopi ed applicazioni. Le proprietà caratteristiche dei fluidi supercritici possono essere sfruttate nei processi di micronizzazione. Negli ultimi anni i processi di precipitazione dei composti farmaceutici e naturali hanno ricevuto un enorme interesse. I processi convenzionali, come lo spry-drying, freeze-drying e i processi di macinazione, presentano diversi svantaggi: (1) produzione di particelle grossolane, (2) degradazione termica e meccanica del prodotto finito, (3) prodotto finito impuro, contenente tracce di solventi e interferenti tossici. Per queste ragioni, è stato applicato un processo di micronizzazione con fluidi supercritici, definito come SAS (Supercritical Anti-Solvent), per il recupero di polifenoli da estratti di vinaccia. Un disegno sperimentale fattoriale completo (23) è stato applicato per lo studio dell’effetto dei principali parametri di processo (pressione, temperatura e frazione molare del CO2) sulla quantità di particelle recuperate, il contenuto di polifenoli totali e l’attività antiossidante. I campioni con i migliori risultati sono stati ottenuti a 12 MPa, 45°C e 0.99 di frazione molare del CO2. I campioni migliori ottenuti nelle prove sperimentali sono stati inoltre caratterizzati mediante il frazionamento delle proantocianidine, l’analisi HPLC-DAD dei polifenoli e l’analisi al microscopio a scansione elettronica (SEM). Sulla base dei dati di letteratura sono state effettuate considerazioni economiche, e discusse le prospettive future delle possibili applicazioni dei fluidi supercritici nei processi industriali